Laman

Minggu, 31 Mei 2009

PEMBUATAN MEDIA MS

Latar Belakang
Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur untuk pertumbuhannya yang normal. Tiga unsur di antaranya adalah unsur C, H, dan O yang diambil dari udara, sedangkan unsur lainnya dalam bentuk pupuk yang dapat diberikan melalui akar atau daun. Pada perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan, unsur-unsur tersebut diberikan melalui akar yaitu dengan menambahkannya pada medium agar. Semua unsur tersebut dibutuhkan oleh tanaman untuk pertumbuhan, ada yang dibutuhkan dalam jumlah banyak ( makro ) dan yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit ( mikro ) ( Wijayani, 1994 ).
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral unsur hara makro dan unsur hara mikro, vitamin, dan Zat pengatur tumbuh (hormon). Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, agar, arang aktif, bahan organik .Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf ( Luri, 2009 ).

Tujuan

Mengetahu cara pembuatan media MS
Mengetahui kandungan media MS

TINJAUAN PUSTAKA

Ada dua macam medium, yaitu media alami dan media sintetik. Media alami adalah media yang diperoleh dari jaringan hewan, misalnya serum. Media sintetik adalah media buatan, misalnya TCM (Tissue Culture Medium) mengandung nutrisi yang mendukung kehidupan sel. Media ini merupakan media sintetik yang umum (non selektif) yang memungkinkan berbagai macam sel dapat tumbuh di media tersebut. Pada TCM terkandung berbagai unsur penting seperti asam amino, glukosa, air, molekul organik, vitamin dan garam-garam yang mendukung kelangsungan hidup sel ( Imron, 2007 ).
Serum merupakan sumber berbagai nutrisi yang dibutuhkan oleh sel untuk perkembangannya, tetapi serum sangat mahal dan berpotensi menyebabkan kontaminasi. Serum mengandung protein yang berfungsi sebagai agen pembawa dan pelindung molekul lainnya. Media sintetik memiliki beberapa keuntungan antara lain lebih murah, sumber potensial dari agen infeksi sudah digantikan, memiliki komponen tambahan yang biasanya tidak terdapat pada jaringan hewan ( Imron, 2007 ).
Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm ( Cleandgreseach, 2009 ).
Media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up) ( Cleandgreseach, 2009 ).
Bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin ( Cleandgreseach, 2009 ).

BAHAN DAN ALAT


A. Bahan
1. Agar
2. Gula ( Sukrosa )
3. Aquades
Stok Makro
1. KNO3
2. NH4NO3
3. CaCl2.2H2O
4. MgSO4.7H2O
5. KH2PO4
Stok Mikro
1. MnSO4.4H2O
ZnSO4.4H2O
H3BO3
Kl
NaMoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O

B. Alat
1. Timbangan Analitik
2. Gelas Piala
3. pH meter
4. Pipet
5. Stirer
6. Kompor gas
7. Panci+ Pengaduk
8. Aluminiumfoil
9. Tissu
10. Korek api
11. Magnetik stirer


PROSEDUR KERJA


Stok mikro:
2. Hitung bahan-bahan yang akan dipakai untuk membuat larutan stok, kemudian timbang
3. Buatlah larutan 350ml dengan mencampur bahan-bahan tersebut dengan stirer, kemudian ukur pHnya
4. Tambah volume dengan aquades sampai 500ml
5. 5 ml stok mikro digunakan untuk membuat 1 L media MS
6. Didihkan larutan diatas kompor
7. Agar dan gula sambil diaduk, angkat bila sudah homogen
8. Masukkan dalam botol steril, tutup botol
9. Sterilisasi dengan autokalf
10. Letakkan dalam inkubator
Catatan: Cara membuat lrutan stok makro sama dengan stok mikro


PEMBAHASAN


Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf (
SmallCrab, 2009 ).
ZPT (zat pengatur tumbuh) dibuat agar tanaman memacu pembentukan fitohormon (hormon tumbuhan) yang sudah ada di dalam tanaman atau menggantikan fungsi dan peran hormon bila tanaman kurang dapat memproduksi hormon dengan baik. Sitokinin, hormon tumbuhan turunan adenin berfungsi untuk merangsang pembelahan sel dan diferensiasi mitosis, disintesis pada ujung akar dan ditranslokasi melalui pembuluh xylem. Aplikasi Untuk merangsang tumbuhnya tunas pada kultur jaringan atau pada tanaman induk, namun sering tidak optimal untuk tanaman dewasa. merk dagang antara lain: Novelgrow. Sitokinin alami terdapat pada air kelapa.golongan sitokinin : Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA ( Plantea, 2008 ).
Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar (dari rumput laut) atau pengganti agar seperti Gelrite atau Phytagel (bersumber dari bakteri). Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7-1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin kadang-kadang digunakan pada lab komersial. Gel sintetis diketahui dapat menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental untuk 1 L media ( Sihotang, 2009 ).
Media tanam kultur jaringan terdiri dari dua jenis yaitu media cair dan media padat. Media cair digunakan untuk menumbuhkan eksplan sampai terbentuk PLB ( Protocorm Like Body ). Media padat digunakan untuk menumbuhkan PLB sampai terbentuk planlet. Media padat dibuat dengan melarutkan nutrisi dan agar-agar ke dalam akuades dam disterilkan. Media kultur harus mengandung nutrisi lengkap, terdiri dari unsur makro, unsur mikro, vitamin, gula, dan ZPT ( Rahardja, 2004 ). Pembuatan media MS adalah sebagai berikut: ( David, 2008 ).
Stok Makro: NH4NO3 33 g, KNO3 38 g, MgSO4.7H2O 7,4 g, KH2PO4 3,4 g, CaCl2.2H2O 8,8 g. Semua bahan dilarutkan dalam 1 L air disimpan dalam botol gelap. stok ini bisa buat pengenceran 20 kali (20 L mediA).
Stok Mikro: KI 83 mg, H3BO3 620 mg, MnSO4.4H2O 1690 mg, ZnSO4.7H2O 860 mg, Na2MoO4 25 mg, CuSO4.5H2O 2,5 mg, CoCl2.6H2O 2,5 mg. Semua bahan dicampur dalam 200 ml air simpan dalam botol gelap. stok ini bisa untuk 100 kali pengenceran (100 L)
Stok NaFeEDTA 3,67 mg dalam 500 ml air.
Stok Vitamin: asam nikotinat 5 mg, Pyridoxine HCl 5 mg, Thiamin HCl 1 mg, Glisine 30 mg. Semua bahan dilarutkan dalam 100 ml air. stok ini untuk 10 kali (10 L)
Cara pembuatan 1 L media campurkan 50 ml stok makro, 2 ml stok mikro, 10 ml NaFeEDTA, 10 ml vitamin, ditambah 100 mg myoinositol dan gula/sukrosa 40 g. dilarutkan dalam 1 L air. tambahkan ZPT yang kita pakai (sitokini/auksin). kemudian di pH 5,8. selanjutnya ditambah agar-agar 8,5 g. larutan lalu dimasak sampai mendidih. masukkan dalam botol kultur. lalu di autoclaf (sterilisasi). dinginkan. media siap dipakai ( David, 2008 ).
Di dalam media terkandung : 1> unsur-unsur mineral makro (Nitrogen (N) 25-60 mM, Kalium, Fosfor (P) 1-3 mM, Kalsium (Ca) 1-3 mM, Magnesium (Mg) 1-3 mM, Sulfur (S) 1-3 mM)); 2> unsur-unsur mikro (Besi (Fe) 1 m M, Mangan (Mn) 5-30 m M, Seng (Zn), Boron (B), Tembaga (Cu) 0.1 m M, Molybdenum (Mo) 1 m M, Cobalt (Co) 0.1 m M, Iodine (I) Nickel (Ni), aluminum (Al), and silicon (Si)); 3> senyawa organik (gula, sukrosa, dan lainnya) 20 to 40 g/l; 4> vitamin (thiamin (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (B6), dan myo-inositol); 4> arang aktif; dan 5> Zat pengatur tumbuh, yang bisa digunakan, yakni: dari golongan auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA), golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA, dan golongan Gibberelin seperti GA3 ( Sihotang, 2009 ).
Boron sebagai unsur mikro, tidak diberikan dalam bentuk garam, tetapi dalam bentuk asam yaitu H3BO3. feri tartada, Feri EDTA diberikan sebagai sumber zat besi dan sebagai buffer atau larutan penyangga supaya pH media tetap stabil( Rahardja, 2004 ). pH media biasanya diatur 5.5 pada saat persiapan. pH media dapat memepngaruhi kelarutan hara, pengambilan hara oleh tanaman dalam kultur dan pembekuan agar atau pengaruh terhadap morfologi. Satu hal yang seringkali diabaikan adalah perubahan pH pada media akibat proses pemanasan dengan autoklaf ( Udayana, 2008 ).
Sebagai pelengkap nutrisi di tambahkan asam glisin, myoinositol, asam nikotinal, tiamin HCl ( Vitamin B1 ), pirodoksin HCl ( Vitamin B6 ), niasin dan sukrosa ( Rahardja, 2004 ). Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman, adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman. Nicotinic acid, penting keberadaannya di dalam media kultur akar tomat, ercis dan lobak, begitu juga pyroxidin diperlukan dalam kultur akar tomat ( Anonim, 2009 ).
Myo-inositol atau meso-inositol atau i-inositol digunakan dalam media untuk memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis, sehingga myo-inositol dianggap sebagai golongan vitamin untuk tanaman. Menurut Myo-inositol berperan dalam keikutsertaan dalam lintasan biosintesa asam-D-galakturonat yang menghasilkan vitamin C dan pectin serta kemungkinan inkorporasinya dalam fosfoinositida dan fosfatidil inositol yang berperanan dalam pembelahan sel. Penambahan myo-inositol dengan konsentrasi antara 20-100 mg/l pertama kali ditunjukkan oleh Jacquiot dalam kultur kambium tanaman elm. Myo-inositol berpengaruh dalam morfogenesis kultur, misalnya dalam kultur Haworthia sp. Pembentukan pucuk dalam Haworthia sp. tergantung dari keberadaannya myo-inositol. Di alam Myo-inositol ditemukan dalam air kelapa, dan dalam jumlah kecil didalam agar dipasaran. Myo-inositol juga digunakan dalam pembuatan media Wood & Braun dan Murashige & Skoog ( Anonim, 2009 ).
Pantothenic acid mempunyai peranan penting dalam pertumbuhan jaringan tanaman tertentu, seperti Salix sp. tidak semua jenis tanaman membutuhkan penambahan pantothenic acid, contohnya pada kultur jaringan wortel. Vitamin E (tocopherol) yang ditambahkan ke dalam kultur jaringan tanaman dapat memacu pembentukan kalus friable (remah) dalam kultur embrio jagung sedangkan dalam kultur suspensi kedelai, merangsang penyebaran sel pada konsentrasi 0.95 mM ( Anonim, 2009 ).
Sterilisasi media yang baik dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut: ( Cleandgreseach, 2009 )
Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf besar.
Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panel-dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel.
Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar .
Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat)
Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka.
Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen.
Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap.
Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave.
Tutup katup pengeluaran uap.
Amati kenaikan temperature dan tekanan.
Setelah tekanan mencapai 15 psi, api kompor dikecilkan.
Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat.
Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.
Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up
Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media.

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Pembuatan media MS dilakukan dengan mencampur unsur makro, unsur mikro, vitamin, gula, dan ZPT serta agar dengan cara dididihkan kemudian disterilisasi dan disimpan dalam inkubator.
Media MS mengandung unsur makro, mikro, vitamin, dan ZPT

Saran

Pembuatan larutan stok mikro dan stok mikro dalam media MS harus dilakukan dengan teliti agar eksplan dapat tumbuh dengan baik.
Sterilisasi media harus dilakukan dengan baik, agar tidak terjadi kontaminasi

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2009.Vitamin, Asam Amino, Dan Senyawa N Organik. ( On-line ). http://e-learning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20III%20MEDIA/III3%20Komposisi%20VIT%20%20&%20AS%20AMINO.htm. 19 Mei 2009.


Cleandgreseach. 2009. Kultur Jaringan dr UNRAM . ( On-line ). .http://cleandgreseach.wordpress.com/2009/01/15/kultur-jaringan-dr-unram/. 28 April 2009.

David. 2008. Pembuatan Media MS Untuk Kultur Jaringan. ( On-line ). http://aglao08.multiply.com/journal/item/3/Pembuatan_Media_MS_Untuk_Kultur_Jaringan. 19 Mei 2009.

Hawaauriz. 2009. Catatan Kecil. ( On-line ). http://hawaauriz.wordpress.com/. 19 Mei 2009.

Imron, A. Tamyis Ali . 2007. SterilisasiI Alat Dan Pembuatan Medium Kultur. ( On-line ). http://cyber-biology.blogspot.com/2008/09/div-alignjustify-laporan-praktikum.html.14 Mei 2009


Luri, Sepdiana. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. ( On-line ). http://kultur-jaringan.blogspot.com/2009/03/kultur-jaringan-tanaman.html. 30 April 2009.

Plantea. 2008. Sedikit Tentang Zat Pengatur Tumbuh. ( On-line ). http://yoxx.blogspot.com/2008/05/sedikit-tentang-zat-pengatur-tumbuh.html. 18 mei 2009.

Rahardja, P.C. dan Wahyu Wiryanto. 2004. Aneka Cara Memperbanyak Tanaman. Jakarta: Agromedia Pustaka.

Sihotang, Benidiktus. 2009. Pengertian Kultur Jaringan (Kultur In Vitro). ( on-line ). http://www.benss.co.cc/budidaya-tanaman/140-perbanyakan-tanaman-dengan-kultur-jaringan?tmpl=component&print=1&page . 19 Mei 2009.

SmallCrab. 2009. Mengenal Kultur Jaringan. ( On-line ). http://www.smallcrab.com/others/35-lain-lain/474-mengenal-kultur-jaringan. 19 Mei 2009.

Udayana . 2008 . Pembentukan Kultur Aseptik. ( On-line ). http://www.fp.unud.ac.id/biotek/kultur-jaringan-tanaman/5-pembentukan-kultur-aseptik/. 19 Mei 2009.

Wijayani, Ari. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar